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临床化学检验辅导资料:第七章 临床生化自动化分析

时间:2013-07-13 18:38来源:临床医学检验技术考试 作者:lengke 点击:
  

第七章 临床生化自动化分析

自动生化分析仪将生化分析中的取样、加试剂、混匀、保温反应、检测、结果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗等步骤组合在一起自动操作。按其工作方式不同分为连续流动式或管道式、分立式、离心式和干片式。

一、分立式自动生化分析仪的结构

(一)基本结构

1.样品盘或样品架 样品盘是能放置样品杯或采血试管的转盘;样品架是能放置样品杯或采血试管的架子,可通过样品传送带进行移动,其优点是可不断追加新的样品架,以及能将样品传送到另一分析模块甚至另一分析仪上再进行分析。

2.试剂室和试剂瓶 试剂室内可装有放置试剂瓶的转盘,转盘转动时某一试剂瓶内试剂被吸取;或摆放许多试剂瓶,每个试剂瓶内引出一条试剂管路及其喷嘴。试剂室均具有冷藏装置。大型分析仪常有第一试剂室和第二试剂室。

3.反应杯和反应盘 反应杯即作反应管又作比色杯,由透光性好的硬塑料或石英玻璃制成,反应杯围成一圈组成一个反应盘,在测定过程中作恒速圆周运动,静止时向反应杯中加入样品、试剂或进行搅拌混匀,相对静止时经过检测窗口的比色杯可进行吸光度检测。

4.取样和加试剂装置 取样装置由取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门组成,取样针尖具液面感应功能,并设有防撞装置。取样针大多数采用水洗方式,也有采用化学惰性液的方式。加试剂装置有两类,一种类型的组成与取样装置类似,其液面感应系统能检测并提示试剂剩余量。另一种类型为灌注式,每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴,因而不存在各试剂间的交叉污染。

5.混匀与搅拌装置 样品与试剂通过棒搅充分混匀。

6.温控和定时系统 反应杯浸浴在恒温循环水或恒温空气中。检测吸光度有一定间隔时间,总反应时间一般在8-10min内。

7.光路和检测系统 光源一般为卤素钨丝灯,也有采用长寿命的氙灯。单色器采用干涉滤光片分光系统,或光栅分光系统,常用波长有340、380、405、500、550、600、660nm等。光栅分光有前分光和后分光两种方式,后分光是光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上。检测器由光敏二极管及放大电路组成。

8.数据处理系统 能计算测定结果、判断结果准确性、保存各种数据和自我诊断功能等。

9.清洗系统 反应和检测结束后反应杯就被冲洗系统及时冲洗,然后做杯空白吸光度检查;样品针、试剂针和搅拌棒一般在用于下一个样品、试剂或反应杯前即清洗一次;在一批检测完成后,则自动进行清洗剂清洗,清洗剂可配有1至3种。

(二)组合式自动分析仪

组合式自动生化分析仪将相同或不同的两台或两台以上的分析部分,采用样品架方式使样品通过传输线在不同分析模块间进行传递并检测。实验室自动化系统组合各自动分析系统如生化分析系统、免疫分析系统以及血液分析系统等,可包括样品前处理系统、样品输送系统和各样品分析系统。

二、生化自动化分析方法概要

(一)分析方法类型

1.终点法 被测物质在反应过程中完全被转变为产物,根据终点吸光度的大小求出被测物浓度,实际上称为平衡法更为恰当。

一点终点法是在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值计算结果。两点终点法则在被测物反应或指示反应尚未开始时选择第一个吸光度,在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度,将两点吸光度之差计算结果。该法能有效地消除溶血、黄疸和脂浊等样品本身光吸收造成的干扰。在双试剂分析中,如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前,此时指示反应一般尚未开始,则能容易设置两点终点法。

2.固定时间法 指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点,此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度,这两点的吸光度差值用于结果计算。该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题,例如苦味酸法测定肌酐。

3.连续监测法 又称速率法,是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时,连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值,并以此期单位时间吸光度变化值(ΔA/min)计算结果。该法的优点是可以确定线性期并计算ΔA/min,从而可准确计算酶活性。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度,一般是某些基于酶法测定的代谢物。

4.透射比浊法 抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物,在反应液中具有一定的浊度,进行透射比浊测定,可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。

(二)常用生化检测项目分析方法举例

1.终点法检测 总胆红素、结合胆红素、血清总蛋白、血清白蛋白、总胆汁酸、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、尿酸、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇(直接测定法)、钙、磷(紫外法)、镁等。

2.固定时间法 苦味酸法测定肌酐等。

3.连续监测法 酶活性如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定如葡萄糖(己糖激酶法)、尿素(脲酶偶联法)等。

4.透射比浊法 载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子,以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等。

三、分析参数设置

(一) 分析参数介绍

1.必选分析参数 是分析仪检测的前提条件,没有这些参数无法进行检测。包括试验名称(test code)、方法类型(也称反应模式)(assay mode)、反应温度、主波长(primary wavelength)、次波长(secondary wavelength)、反应方向(response direction)、样品量(sampling volum,一般是2μl~35μl,以0.1μl步进,个别分析仪最少能达到1.6μl。可设置常量、减量和增量)、第一试剂量 (first reagent volum一般是20~300μl,以1μl步进)、第二试剂量(second reagent volum)、总反应容量(total reacting volum,一般是180~350μl,个别仪器能减少至120μl)、孵育时间(incubate time,在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间,在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点止的时间)、延迟时间(delay time,连续监测法中样品与反应试剂混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间)、连续监测时间(continuous monitoring time,延迟时间之后即开始,一般为60~120s,不少于4个吸光度检测点)、校准液(calibrator)个数及浓度或或理论K值、小数点位数(decimal point digit)。

2.备选分析参数 这类分析参数与检测结果的准确性有关,一般来说不设置这类分析参数,分析仪也能检测出结果。包括线性范围(linearity range)、样品预稀释、底物耗尽值(substrate exhaust limit,在负反应的酶活性测定中,规定的吸光度下降限。若低于此限时底物已太少,不足以维持零级反应而导致检测结果不准确)、前区检查(将终点法最后两个吸光度值的差别设置一个限值,如果后一点的吸光度比前一点低,表示已有抗原过剩)、试剂空白吸光度范围、试剂空白速率、方法学补偿系数(用于校正不同分析方法间测定结果的一致性,有斜率和截距两个参数)、参考值范围。

3.某些参数的特殊意义 最小样品量、最大试剂量、弹性速率和试剂空白速率等。弹性速率(flexrate)指在酶活性测定中,酶活性太高时在连续监测期中已不呈线性反应时,有些仪器具有弹性速率功能,能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果。

(二)单波长和双波长方式

采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长方式,使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。双波长测定能①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰。选择次波长应使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值,而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异,一般来说,次波长应大于主波长100nm。

(三)单试剂和双试剂方式

反应过程中只加一次试剂称单试剂方式,加两次试剂便为双试剂方式。目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析,其优点是:①可提高试剂的稳定性;②能设置两点终点法;③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应干扰。

(四)测定过程的自动监测

1.试剂空白监测 试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质。

2.试剂空白变化速率监测 一些酶试剂或其他试剂在反应温度下不稳定,其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化,这种变化会影响测定结果的准确性。设置此项监测可使分析仪在结果计算时自动减去试剂空白变化速率。

3.样品信息监测 根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性,用双波长或多波长检测其性质和程度,然后在结果计算时自动减去这部分干扰。

4.结果可靠性监测 终点监测:判断所选的测光点是否到达终点或平衡点。线性期监测:①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归,根据各点方差值的大小来判断是否呈线性;②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较来判断是否为线性期。

5.底物消耗的监测 在连续监测法测定酶活性时,如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值,则说明该样品酶活性非常高,底物将被耗尽。

6.方法线性范围监测
 

 

四、自动生化分析仪的工作过程和操作方法

(一)工作过程

在测定过程中所有机械步骤均由微处理器根据已设定的程序进行工作。包括取样加试剂和混匀、保温反应和吸光度检测和计算并显示或打印结果。

(二)操作方法

操作步骤如下:

1.操作前的各项检查

2.校准 校准方式有单点校准、两点校准和多点校准,多点校准可按其线形选择不同的曲线方程进行拟和,如双曲线、抛物线、幂函数、指数函数、对数函数等方程等。校准频度按检测方法原理和试剂的稳定性不同而确定,如每日校准、每周校准、每月校准、每两月校准等,至少每六个月进行一次校准。

3.质控品测定

4.检测项目的输入与测定

5.样品的减量重做

6.分析仪维护 要严格根据操作手册的要求,进行每天维护、每周维护、不定期维护等。

7.分析仪数据连网 指分析仪与实验室网络系统之间分析数据的互传与共享。

(三)自动化分析与手工操作的比较

1.优点 包括检测速度快、检测灵敏度高、检测准确度高、检测精密度高、样品和试剂用量少,以及能精确地控制反应时间、精确地控制反应温度和进行复杂的结果计算等。

2.缺点 选择次波长较困难、操作时间受限、操作复杂性受限(如加试剂的次数,无法离心、过滤、萃取、煮沸,选择和改变反应温度困难等)、样品量/试剂量的比例受限制、不适宜做参考方法,以及仪器维护和保养较复杂等。

五、干片式生化分析仪简介

由干片试剂和检测仪器两部分组成,前者从上到下分为展开层、试剂层、显色层和支持层,检测仪器也有半自动和全自动之分。测定不同待测物利用不同的方法原理。样品在干片试剂各层中的反应过程如下:

(1)待测样品在展开层样品均匀展开,大分子物质被阻挡不能进入试剂层。

(2)样品中的水分进入试剂层成为干式试剂的溶剂,试剂与待测物质进行化学反应。

(3)化学反应产物在显色层与显色试剂起呈色反应。

(4)经过一定时间,光度计的单色光透过支持层、显色层和试剂层,一部分光线被吸收,另一部分光线则反射到接收器被检测。

六、自动生化分析仪性能评价

生化分析仪有全自动和半自动之分。全自动分析仪将取样至出结果的全过程都自动完成。半自动分析仪的工作原理为连续流动式分析,不同样品反应液之间互染率大,每个样品检测后均需冲洗才能进行下一个测定,某些步骤如加试剂、取样、混合、保温等需手工完成。

生化分析仪的分析性能也包括准确度、精密度、检测范围等,另外,分析速度是自动生化分析仪最重要的分析性能。

(一)分析速度

影响分析速度的因素有通道数量、取样周期、反应杯数量、一次能容纳的样品数量、试剂瓶容量、合适的项目组合等。

(二)分析仪性能指标

自动生化分析仪的性能可包括五个方面:准确度、精密度、检测能力(包括检测方法、检测时间、加试剂次数、检测范围等)、分析速度和检测成本,分析仪生产厂家关于其分析仪的介绍资料中通常列出许多性能指标,这些指标实际上是这五方面性能的解释。

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